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    豬傳染性胃腸炎病毒一步法RT-PCR檢測試劑盒說明書(20次)

         更新時間:2019-06-06       瀏覽量:
    【注意】接到貨后請認真閱讀注意事項。
    【用途】用于豬傳染性胃腸炎病毒病的檢測、診斷和流行病學調查。
    【試劑】
    【操作步驟】
    1.RNA提取  

    (1)取疑似豬傳染性胃腸炎病毒病的病料(空腸、小腸及其內容物等),用Hank’s液或PBS研磨成1:3懸液,在-20 ℃反復凍融3次,經3 000 r/min離心5 分鐘,上清液再經12 000 r/min離心15分鐘,上清液-70 ℃保存備用。
    (2)取200uL上清液(或標準品T),移入新的1.5mL滅菌EP管中,加入400uLSR-I,反復顛倒幾次混勻,室溫放置5~10分鐘。
    (3)加入200uL氯仿,漩渦振蕩15秒混勻。室溫下放置2~3分鐘。
    (4)12000r/min離心10分鐘,取上層水相(注意:切勿吸取到里兩相之間的雜質),轉移到一個新的EP管中,再加入等體積異丙醇混勻,室溫放置10分鐘。
    (5)12000r/min離心10分鐘,棄去上清,加入SR-II 700uL,充分洗滌沉淀RNA后,12000r/min離心5分鐘,小心吸去上清(注意:嚴格防止RNA丟失)。
    (6)用潔凈吸水紙吸干管壁的SR-II,室溫放置2~3分鐘。用20uLTU-5溶解,即為模板,即用或-70℃凍存備用。
    2.One-Step RT- PCR加樣體系
    3.反應程序
    4.電泳
        稱量0.25g瓊脂糖,放入錐形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×濃縮液,儲存備用),于微波爐中熔解,加入1.5uL的TU-8混勻。封閉好電泳槽,加入梳子,倒入瓊脂凝膠,待凝固后,將PCR產物5uL混合1uL TU-7,加樣于凝膠孔中,同時在相鄰孔加3uLTU-6,在120v 電壓下,1×TAE液中電泳15分鐘,在紫外成像儀下觀察結果。
    【結果判定】
     在約1128bp位置出現擴增帶,實驗結果為陽性(如圖)。                              
    1.DL2000 Marker      
    2.標準陽性片段
    【注意事項】
    1.每次使用,開蓋之前請先瞬時離心,使試劑沉于管底。
    2.本試劑盒為20頭份量診斷試劑,操作失誤或移液器不準確造成最終劑量不夠情況,不予負責。
    3.所有試劑在要求溫度下保存,-20℃保存試劑盡量減少反復凍融,使用后的試劑立即放回,避免在室溫擱置太久。
    4.盡量建立PCR試驗操作區,避免交叉污染,RNA抽提嚴格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并經常更換。
    5.加樣和反應程序嚴格按照說明書進行,由于操作失誤、移液器不精確、定時不準確造成無結果情況,不予負責。
    6. 槍頭、離心管和PCR管在使用前,最好用DEPC水(0.1%)處理,然后高壓滅菌后烘干,操作過程盡量不要用手接觸,可用鑷子夾取。
    7.注意防止試劑污染,在有效期限前用完。
    8. TU-8所裝試劑為致癌物質,避免接觸到皮膚。如若不甚接觸,請立即用洗滌劑清洗。
    【有效期】
    本制品有效期為1年,生產日期見包裝側面。
    【聯系人】   王金良、管宇            電話:0543-3403060
    僅供獸醫診斷使用



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    編輯:熊方方




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