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    山羊痘病毒實時熒光PCR檢測試劑盒說明書

         更新時間:2021-02-19       瀏覽量:
    【用途】 用于山羊痘病毒核酸的檢測。
    試劑
    編號 20T 50T 保存
    裂解液 4mL 10mL 室溫 A盒
    無水乙醇 4mL 10mL 室溫
    去蛋白漂洗液 12mL 28mL 室溫
    洗滌液 32mL 77mL 室溫
    洗脫液 2mL 5mL 室溫
    蛋白酶K 0.2mL 0.5mL -20℃ B盒
    PCR反應液 200μL 500μL -20℃
    引物和探針 40μL 100μL -20℃
    陽性對照 30μL 30μL -20℃
    滅菌水 300μL 300μL -20℃
     
    【操作步驟】
    1.樣本前處理及核酸提取  
    樣本前處理:
    取適量皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結,于滅菌研缽充分研磨,用PBS按照1:3體積稀釋成均勻乳劑,經10 000rpm離心3 min。
    核酸提?。?br /> (1)取200μL上述樣本離心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL離心管,然后加入200μL裂解液,劇烈振蕩。(蛋白酶K開蓋使用后建議存于2-8℃)混勻5~10秒。
    (2)56℃溫浴10分鐘。
    (3)在上述離心管中加入200μL無水乙醇,充分振蕩混勻5~10秒。
    (4)將步驟3中混勻的液體轉移至一只套有收集管的純化柱上,10 000rpm離心1分鐘,棄去套管內液體。
    (5)將500μL去蛋白漂洗液加入純化柱上,10 000rpm離心1分鐘,并棄去套管內液體。
    (6)將700μL洗滌液加入純化柱上,10 000rpm離心1分鐘,并棄去套管內液體。
    (7)可選:重復步驟(6)。
    (8)再將純化柱放回接液管上,13 000rpm離心1分鐘。
    (9)將純化柱移到一只干凈的1.5mL離心管中。
    (10)向離心柱內加50μL洗脫液,室溫靜置1分鐘后12 000rpm離心1分鐘,棄純化柱,離心管內液體中含有基因組DNA。提純的基因組DNA如果不立即使用,請保存于-20℃。
    2. 熒光PCR加樣體系(總體系20 μL)將下列試劑加入PCR反應管中。
    PCR反應液
    引物和探針
    10μL
    2μL
    模   板
    滅菌水
    2μL
    6μL
     
    (注:陰、陽性對照設立,由試劑盒提供的陽性對照、滅菌水直接替換“模板”即可。)
     
    3. 反應程序
    在熒光PCR儀上進行以下反應:95 ℃ 180s,循環95 ℃ 5 s,55℃ 10 s,72℃ 20 s,共45次, 每次循環的第三步(72℃ 20 s)收集熒光信號(報告基團“HEX”,淬滅基團“BHQ1”)。
    【結果判定】
    1 閾值設定
    檢測結束后,根據收集的熒光曲線和 Ct值直接讀取檢測結果,Ct值為每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整,以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。 
    2 質控標準
    (1) 陰性對照:無Ct值無擴增曲線。
    (2) 陽性對照:Ct值≤30.0,并出現典型的擴增曲線。若陰、陽性對照組結果不成立,則視為無效檢驗。
    3 結果描述及判定
    陰性  被檢樣品無Ct值且無明顯擴增曲線,判為山羊痘病毒核酸陰性;
    陽性  檢測樣品Ct值≤42.0且出現典型的擴增曲線時,判為山羊痘病毒核酸陽性;
    可疑  對于Ct值>42.0的樣品且出現典型的擴增曲線或者Ct值≤42.0但無典型的擴增曲線時,應重檢,重檢Ct值≤42.0且出現典型的擴增曲線時判為陽性,其他情況均判為陰性。
    【注意事項】
    1.B盒使用之前請完全溶解并離心數秒后使用,蛋白酶K開蓋使用后建議保存于2-8℃。
    2 反復凍融試劑將降低檢測靈敏度,盡量減少反復凍融。
    3 為避免樣本間的交叉污染,模板最后加,加模板時先加陰性對照,再加檢測樣品,最后加陽性對照,有條件的實驗室加模板的移液器應與加其它組份的移液器分開。
    4 上機前注意檢查確保反應混合液內無氣泡,且反應管蓋緊,以免熒光物質泄漏區污染儀器。
    【生產企業】   
    企業名稱:山東綠都生物科技有限公司
    生產地址:山東省濱州市經濟開發區黃河二路169號綠都生物工程高科技園
    電    話:0543-3403060       傳    真:0543-3403060
    【有效期】本制品有效期為1年,生產日期見包裝內側。
     
    僅供獸醫診斷使用



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    編輯:熊方方




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